Screening for in vitro inhibiting Nrf2 of some Vietnamese medicinal plants
- School of Medicine, Vietnam National University Ho Chi Minh City, Viet Nam
- Faculty of Applied Science, Ho Chi Minh City University of Technology, Vietnam National University Ho Chi Minh City, Viet Nam
- Graduate Institute of Natural Products, School of Pharmacy, Kaohsiung Medical University, Taiwan
Abstract
Nuclear factor erythroid 2–related factor 2 (Nrf2) is vital in regulating cellular defenses against oxidative or environmental aggressors. Some studies reveal that increasing Nrf2 activity affects chemotherapy drug resistance in cancer; thus, Nrf2 has become an attractive target in cancer therapeutics research. Our study screened the effects of 52 methanol extracts from different parts of 24 medicinal plants used in traditional and folk medicine to evaluate the ability to inhibit Nrf2 and the cell viability by an in vitro model of Huh7 liver cancer cells at the crude extract concentration of 100 µg/mL. The study has successfully suggested a screening model for Nrf2 expression based on luciferase fluorescence assay of Huh7 cells transfected with the Nrf2 gene. The results of our study show that the Piper sarmentosum roots can inhibit nearly 90% of Nrf2 activity in cancer cells. We also found that the extracts of Vernonia amygdalina leaves, Phyllanthus amarus leaves, Zingiber zerumbet leaves, Hyptis suaveolens leaves and roots, Curcuma zedoaria leaves and roots, Luvunga scandens leaves, Helicteres hirsuta leaves, Oroxylum indicum stem and leaves, Lasia spinosa fruits and Crotalaria pallida leaves inhibited more than 60% of Nrf2 expression levels. Furthermore, the extracts from the leaves of Luvunga scandens and Curcuma zedoaria can cause toxicity on cancer cell of more than 70% at 100 µg/mL. From the study, we have the basis for further studies on natural active substances that have the effect of drug resistance by inhibiting the expression of Nrf2 on cancer cells.
Mở đầu
Ung thư được định nghĩa là hiện tượng tăng sinh bất thường của tế bào với khả năng xâm lấn hoặc lây lan sang các cơ quan khác của cơ thể1. Ước tính đến năm 2040, số ca mắc ung thư mới có thể lên đến 28,4 triệu, trong đó khu vực Châu Á thuộc top đầu khu vực có tỷ lệ mắc ung thư cao nhất với khoảng 5,5 triệu ca mới, và khoảng 4,02 triệu ca tử vong do ung thư2. Hiện nay, nhiều phương pháp khác nhau đã được áp dụng trong điều trị ung thư, tuy nhiên sử dụng thuốc hóa trị vẫn là một trong những liệu pháp phổ biến nhất. Dự đoán đến năm 2040, nhu cầu sử dụng thuốc hóa trị lần đầu cho bệnh nhân ung thư sẽ tăng từ 9,8 lên 15,0 triệu, với tỷ lệ gia tăng là 53%3. Tuy nhiên, thực tế cho thấy 50% trường hợp cơ thể bệnh nhân đã có đề kháng với thuốc hóa trị trước khi được tiến hành điều trị và 50% còn lại xuất hiện trong quá trình điều trị4. Tình trạng kháng thuốc làm cho bệnh nhân không đạt hiệu quả điều trị mong muốn mà còn có thể bị ảnh hưởng xấu bởi tác dụng phụ của thuốc5, được xem là nguyên nhân của hơn 90% trường hợp tử vong ở bệnh nhân ung thư đã di căn6. Do đó, việc nghiên cứu mô hình đánh giá tình trạng kháng thuốc ung thư cũng như kết hợp nghiên cứu các hợp chất có tác dụng hỗ trợ ức chế và/hoặc đảo ngược kháng thuốc điều trị ung thư là nhu cầu hết sức cần thiết.
Nhiều mô hình thử nghiệm đã được đưa ra nhằm đánh giá cơ chế hình thành kháng thuốc trên tế bào ung thư, mô hình tiền lâm sàng gồm mô hình in vitro và in vivo nhằm nghiên cứu khả năng ức chế khối u của các hoạt chất, nghiên cứu cơ sở hình thành kháng thuốc nội tại và kháng thuốc mắc phải trong quá trình điều trị7. Hầu hết các mô hình được sử dụng để nghiên cứu thường tập trung vào tín hiệu của protein ức chế hoặc hoạt hóa apoptosis như con đường PI3K/Akt8, con đường Raf/MEK/ERK9 dựa trên phương pháp PCR, Western Blot và các phương pháp tương đương10. Nuclear factor erythroid-2 p45-related factor 2 (Nrf2) là một yếu tố phiên mã có vai trò bảo vệ tế bào, kể cả tế bào thường và cả tế bào ác tính, khỏi tác động từ các phản ứng oxi hóa, mất cân bằng nội môi và các tổn thương do DNA11. Đối với các tế bào ung thư, hoạt động của Nrf2 dẫn đến tình trạng kháng thuốc hóa trị và được chứng minh là thúc đẩy sự tăng sinh ở tế bào ung thư12, 13. Ngoài ra, kích hoạt Nrf2 cũng có liên quan đến sự phát triển và di căn của khối u ở một số bệnh ung thư14, 15. Nghiên cứu về con đường Nrf2/Keap1 hiện nay đang thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học vì một số nghiên đã chứng minh rằng việc trực tiếp hoặc gián tiếp ức chế biểu hiện Nrf2 có thể làm các tế bào ung thư trở nên nhạy với hóa trị16, 17, 18, 19 và đảo ngược tình trạng kháng thuốc điều trị20. Do đó, nghiên cứu các chất ức chế Nrf2 có thể là một chiến lược điều trị đầy hứa hẹn đối với một số loại ung thư và nâng cao hiệu quả của các loại thuốc hóa trị liệu.
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy khả năng làm giảm/ức chế/đảo ngược tình trạng kháng thuốc hóa trị, thể hiện tác động cộng gộp khi sử dụng kết hợp một số hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ thực vật với thuốc điều trị ung thư và khả năng làm giảm độc tính của thuốc điều trị ung thư21, 22. Một số flavonoid được báo cáo rộng rãi với khả năng tái nhạy cảm tế bào kháng thuốc với thuốc hóa trị và đảo ngược tình trạng kháng thuốc thông qua nhiều cơ chế khác nhau23, 24, 25. Theo nghiên cứu của Tang và cộng sự, 2011, flavone luteolin có khả năng ức chế mạnh với Nrf2 với kết quả làm giảm 34% mức Nrf2 mRNA khi điều trị cùng với actinomycin D sau 30 phút và 43% sau 1,5 giờ đối với tế bào ung thư biểu mô phổi A549 ở người26. Luteolin còn thể hiện khả năng ức chế hoạt động của Nrf2 ở gan chuột và trong các khối u xenograft mà không thể hiện tác dụng gây độc tế bào27. Ngoài ra, một số hợp chất như quercetin, curcumin cũng đang được đưa vào thử nghiệm lâm sàng để khắc phục tình trạng kháng thuốc ung thư28, 29, 30, 31.
Việt Nam được biết đến có nguồn cây thuốc và dược liệu phong phú với hơn 4.000 loài thực vật được ghi nhận có công dụng làm thuốc32. Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu liên quan đến việc sử dụng dược liệu và cây thuốc Việt Nam trong việc điều trị hay hỗ trợ điều trị kháng thuốc ung thư. Trong nghiên cứu này, danh mục 24 loài dược liệu và cây thuốc sử dụng trong dân gian và y học cổ truyền trong việc hỗ trợ điều trị ung thư được thiết lâp. 52 bộ phận khác nhau của 24 loài dược liệu và cây thuốc này được thu thập để đánh giá khả năng sống sót của tế bào cũng như khả năng ức chế Nrf2 in vitrođối với tế bào Huh7 từ các cao methanol thu được. Từ đó đưa ra định hướng để chọn lọc và phát triển các hợp chất có khả năng ức chế biểu hiện của Nrf2 đối với tế bào ung thư.
Phương pháp nghiên cứu
Hóa chất, nguyên liệu và thiết bị
Hóa chất, nguyên liệu
Môi trường Eagle sửa đổi của Dulbecco (DMEM), Huyết thanh nhau thai bò (FBS), Streptomycin, Acid amin không thiết yếu, L-glutamin, Thuốc thử TRIzol Puromycin, Hygromycin, Tris, Sodium Chloride, EDTA, NP-40, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), chất ức chế protease và phosphatase, Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), Alamarblue (Thermo Fisher Scientific, Mỹ); anti-NRF2 (GTX103322, GeneTex, Mỹ), anti-GAPDH (60004-1g, Proteintech, Mỹ), anti-KEAP1 (10503-2-AP, Proteintech, Mỹ), anti-lamin B1 (66095-1-Ig, Proteintech, Mỹ); KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X) Kit (KAPA Biosystems, Mỹ); Luciferase Assay Substrate, Luciferase Assay Buffer, Cell Culture Lysis 5X Reagent (Promega, Mỹ); Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Merck, Đức); Thuốc thử TurboFect (Fermentas, Mỹ); Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Mỹ), Methanol (Xi Long Scientific, Trung Quốc). TOOLs Easy Fast RT Kit (TOOLs Biotechnology, Đài Loan).
Thiết bị
Tủ an toàn sinh học (Sanxiong Technology, Đài Loan), Máy cô quay chân không RE300 (Stuart, London, Anh), Cân phân tích, Synergy HT Multi-Mode Reader (Bio-Tek Instruments Inc, Mỹ); Tủ ủ NuAire CO (NuAire, Mỹ).
Mẫu dược liệu
Nghiên cứu đã tiến hành thu thập các bộ phận khác nhau từ 24 loài dược liệu/cây thuốc tiềm năng để thực hiện sàng lọc hoạt tính ức chế gen Nrf2. Dược liệu/cây thuốc được nhóm tác giả thu hái các bộ phận dùng tương ứng vào tháng 8/2022, tại tỉnh An Giang. Các mẫu dược liệu được định danh bởi TS. Võ Thanh Hóa. Sau khi thu hái, dược liệu/cây thuốc được sửa sạch, để ráo, sau đó cắt nhỏ và sấy ở 50 °C cho đến khi khô hoàn toàn (độ ẩm dưới 10%). Dược liệu/cây thuốc sau khi khô được xay nhỏ và sàng qua rây 1 mm để thu được bột dược liệu. 20 g bột dược liệu được chiết ngấm kiệt với 180 mL methanol trong 3 ngày, sau đó thu dịch lọc và cô quay chân không để thu cao chiết toàn phần tương ứng với mỗi dược liệu.
Nuôi cấy tế bào và cấy truyền DNA
Tế bào HEK293T, Huh7 được cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu và phát triển thuốc (Drug Development and Value Creation Research Center, Đại học Y Cao Hùng, Đài Loan). Tế bào được nuôi cấy trong môi trường môi trường Eagle sửa đổi của Dulbecco (DMEM) với 10% huyết thanh nhau thai bò đã được bất hoạt bằng nhiệt (FBS), penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml), L-glutamine (2 mM), và acid amin không thiết yếu (0,1 mM). Tế bào lentivirus để chuyển nạp được nuôi cấy trong DMEM và được bổ sung hygromycin (100 μg/mL) hoặc hỗn hợp gồm puromycin (1 μg/mL) và hygromycin (100 μg/mL). Thuốc thử TurboFect đã được sử dụng để truyền DNA plasmid theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Mô hình xác định hoạt động của Nrf2 trên tế bào Huh7
Real-time PCR định lượng mức độ biểu hiện mRNA của các gen mục tiêu Nrf2
RNA được phân lập bằng cách sử dụng thuốc thử TRIzol và được phiên mã ngược thành cDNA bằng TOOLs Easy Fast RT Kit. qPCR được thực hiện trên ABI StepOne Plus System (Applied Biosystems, Foster City, CA, Mỹ) bằng KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X) Kit. Mức mRNA được chuẩn hóa với mức mRNA glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Các đoạn mồi được sử dụng thể hiện tại Table 1.
Trình tự các đoạn mồi được sử dụng trong nghiên cứu
|
HO1 (NM_002133) |
Forward |
5′-GCCAGCAACAAAGTGCAAG |
|
Reverse |
5′-GAGTGTAAGGACCCATCGGA | |
|
NQO1 (NM_000903) |
Forward |
5′-TGCAGCGGCTTTGAAGAAGAAAGG |
|
Reverse |
5′-TCGGCAGGATACTGAAAGTTCGCA | |
|
GCLC (NM_001498) |
Forward |
5′-CTGGGGAGTGATTTCTGCAT |
|
Reverse |
5′-AGGAGGGGGCTTAAATCTCA | |
|
ABCC2 (NM_000392) |
Forward |
5′-TACCTAGGCACATGGCTCCT |
|
Reverse |
5′- AGAACAGGCAGGAGTAGGCT | |
|
G6PD (NM_000402) |
Forward |
5′-CAACATCGCCTGCGTTA |
|
Reverse |
5′-CTTGACCTTCTCATCACGG | |
|
COX2 (NM_000963) |
Forward |
5′-GTTCCACCCGCAGTACAGAA |
|
Reverse |
5′-AGGGCTTCAGCATAAAGCGT | |
|
IL-1β (NM_000576) |
Forward |
5′-TGAGCTCGCCAGTGAAATGA |
|
Reverse |
5′-AGATTCGTAGCTGGATGCCG | |
|
TNF-α (NM_000594) |
Forward |
5′- TGGCGTGGAGCTGAGAGATA |
|
Reverse |
5′-CTTGGTCTGGTAGGAGACGG | |
|
MMP1 (NM_002421) |
Forward |
5′-GAGATCATCGGGACAACTCTCCT |
|
Reverse |
5′-GTTGGTCCACCTTTCATCTTCAT | |
|
MMP3 (NM_002422) |
Forward |
5′-TGAAATTGGCCACTCCCTGG |
|
Reverse |
5′-GGAACCGAGTCAGGTCTGTG | |
|
GAPDH (NM_002046) |
Forward |
5′-GCAAATTCCATGGCACCGTCA |
|
Reverse |
5′-TCCTGGAAGATGGTGATGGGA |
Immunoblot để xác định protein Nrf2
Tế bào được rửa bằng dung dịch đệm PBS, sau đó được thu hoạch bằng cách sử dụng dung dịch đệm ly giải RIPA (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS) và bổ sung chất ức chế protease và phosphatase (chứa 1 mM PMSF, 10 μg/mL Leupeptin, 50 μg/mL TLCK, 50 μg/mL TPCK, 1 μg/mL Aprotinin, 1 mM NaF, 5 mM NaPPi và 10 mM Na₃VO₄). Tế bào sau khi ly giải được ly tâm lạnh ở 4 °C với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 15 phút. Nồng độ protein được xác định bằng Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, Mỹ). Các kháng thể được sử dụng bao gồm: anti-NRF2 (GTX103322), anti-GAPDH (60004-1g), anti-KEAP1 (10503-2-AP), và anti-lamin B1 (66095-1-Ig).
Thiết kế plasmid
pGL4.37 [luc2P/ARE/Hygro] (Promega Corporation, Mỹ) được cắt giới hạn bằng enzym SspI và SalI để thu được đoạn Nrf2 reporter 4kB. Plasmid pLKO.1-shLuc (clone#TRCN0000072249) cung cấp bởi National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Đài Loan) được cắt giới hạn bằng enzym ClaI và KpnI để tạo đoạn khung chính chứa các yếu tố cần thiết cho quá trình chuyển nạp vào Lentivirus. Quick Blunting Kit (New England Biolabs, Beverly MA, Mỹ) được sử dụng để cắt phần thừa không tương thích ở đầu 5′ hoặc 3′ trong đoạn plasmid theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi ghép 2 đoạn DNA với nhau, thiết lập bản đồ gen và xác định hướng chèn của plasmid bằng enzym cắt giới hạn SspI và EcoRV. Cấu trúc của plasmid thu được là pLV-ARE-Luc_R. Hai plasmid mã hóa các shRNA khác nhau của Nrf2 bao gồm: shNrf2-1 (5'AGTTTGGGAGGAGCTATTATC, clone #: TRCN0000007555) và shNrf2-2 (5'GCTCCTACTGTGATGTGAAAT, clone #: TRCN0000273494); plasmid kiểm soát RNAi (pLKO.1-shSCR); plasmid đóng gói (pCMV-DR8.91); và plasmid vỏ (pMD.G) từ National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Đài Loan)
Tạo dòng virus chứa plasmid
Để tạo lentivirus, tế bào HEK293T được đồng chuyển nạp với các plasmid đã thiết kế trước đó sử dụng thuốc thử TurboFect theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các hạt nổi có chứa lentivirus được thu hoạch theo quy trình đã được công bố (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw/). Để tạo ra các dòng tế bào ổn định, tế bào Huh7 được nuôi cấy trong môi trường chứa lentivirus và polybrene (8 μg/mL) trong 24 giờ. Các tế bào ổn định sau khi chuyển nạp plasmid được chọn bằng cách nuôi cấy trong môi trường chứa kháng sinh trong 48 giờ.
Kiểm tra khả năng sống của tế bào và hoạt động tương đối của Nrf2
Tế bào Huh7 được gieo trong đĩa 96 giếng (10⁴ tế bào/giếng), sau đó được xử lý với cao chiết nồng độ 100 µg/mL và ủ 18 giờ ở nhiệt độ 37 °C và 5% CO₂. Sau 18 giờ, cao chiết và môi trường được loại bỏ, sau đó thêm vào mỗi giếng 100 µL môi trường nuôi cấy mới và 10 µL Alamarblue (1 mg/mL) sau đó tiếp tục ủ trong 4 giờ. Độ huỳnh quang của resazurin trong alamarblue bị khử được đo ở lớp dung dịch trên của bề mặt nuôi cấy bằng cách sử dụng Synergy HT Multi-Mode Reader và từ đó xác định khả năng sống của tế bào. Sau đó, tế bào được ly giải bằng dung dịch đệm ly giải nhằm thu được protein luciferase. Hoạt động tương đối của Nrf2 trên tế bào Huh7 được xác định bằng cách xác định độ phát huỳnh quang của phản ứng của protein luciferase với luciferin. Giếng đối chứng với DMSO 1% được quy ước là Nrf2 có hoạt tính 100%.
Xử lý số liệu
Kết quả xác định tế bào sống sót và hoạt động của Nrf2 được thu thập bằng phần mềm Gen5. Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 và GraphPad Prsim 9.5.0. Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Kết quả
Kết quả thiết lập danh mục các loài dược liệu được dân gian sử dụng trong hỗ trợ điều trị ung thư
Danh mục 24 loài dược liệu được sử dụng trong hỗ trợ điều trị ung thư theo y học cổ truyền
|
STT |
Tên tiếng Việt |
Tên khoa học |
Các nhóm hoạt chất chính |
Tác dụng dược lý |
Sử dụng trong y học cổ truyền |
|
1 |
Lá lốt |
|
Alkaloid |
Hỗ trợ chữa lành gãy xương |
Trị phong hàn thấp, chân tay lạnh, tê bại. Rối loạn tiêu hóa, nôn mửa, đầy hơi, tiêu chảy, thận và bàng quang lạnh, đau răng, đau đầu |
|
2 |
Rau đắng đất |
|
Triterpenoid saponin (glinoside A và B) |
Kháng khuẩn |
Trị sốt cao, tiểu bí, tiểu buốt, dắt, viêm gan, vàng da, ăn uống không tiêu, dị ứng mẩn ngứa, u nhọt |
|
3 |
Mật gấu |
|
Methyl-2-O-benzyl-d-arabinofuranoside, phytol, acid hexadecanoic, ethyl ester, squalene và 9, 12, 15, acid octadecatrienoic |
Chống ung thư |
Rối loạn dạ dày, vết thương ngoài da, tiêu chảy, ghẻ, giun đũa, viêm amiđan, sốt và nhiễm giun |
|
4 |
Ngãi trắng |
|
Tinh dầu chứa camphor, borneol, vinyldimethylcarbinol, caryophyllene oxide, cubenol, cucumber alcohol, ledol, germacrene D, veridiflorol và nerolidol, b-farnesene, nerolidyl acetate, epiglobulol, trans-Z-a-bisabolene epoxide và cyclohexane |
Kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống viêm |
Chữa bong gân, kiết lỵ và bệnh dạ dày, chữa lành vết thương và gãy xương |
|
5 |
Chó đẻ thân xanh |
|
Alkaloid (securinine, securinol, dihydrosecurinine, phyllanthine, tetrahydrosecurinine, allosecurine, nor-securinine, epibubbialine, isobubbialine, 4-methoxy dihydrosecurinine, 4- methoxytetrahydrosecurinine, 4-hydrosecurinine), flavonoid (quercetin, quercetrin, rutin, gallocatechin, phyllanthusiin, kaempferol), ellagitannin, lignan (phyllanthin, hypophyllanthin, nirurin niranthin, phyltetralin, niranthine, nirtetralin), sterol (amarosterol-A, amarosterol-B) và tinh dầu (linalool, phytol, phyllanthenol, phyllanthenone, phytllantheol) |
Kháng khuẩn |
Trị viêm gan, vàng da; sốt, đau mắt, tiểu tiện bí, rắt; tắc sữa; kinh bế hoặc mụn nhọt; lở ngứa ngoài da; rắn cắn |
|
6 |
Ngải quấn |
|
Phenolic, flavonoid, tannin và alkaloid |
Kháng viêm, giảm đau xương khớp, giảm cân, an thần, chống nhiễm trùng, chống oxi hóa |
Trị phong thấp, đau tai |
|
7 |
Gừng gió |
|
Polyphenol, alkaloid và tinh dầu terpenoid (zerumbone, humulene, humulene oxide, β-caryophyllene, α-caryophyllene và các monoterpenoids). Tinh dầu chứa zerumbone, α-humulene, camphene, humulene oxide I, humulene oxide II, và camphor |
Chống khối u, chống viêm, chống oxy hóa, trị đái tháo đường, chống sốt rét, chống tiết, chống vi khuẩn, chống tăng sinh, chống vi rút, chống dị ứng, hạ nhiệt, giảm đau |
Đau dạ dày, tiêu chảy, viêm nhiễm, đầy hơi, sốt, ngộ độc, dị ứng và nhiễm khuẩn |
|
8 |
É lớn tròng |
|
Tinh dầu, alkaloid, flavonoid (quercetin, acid chlorogenic và rutin) |
Chống oxi hóa, gây độc tế bào |
Chữa cảm sốt, đau đầu, đau dạ dày, ruột chướng khí, đau bụng, nôn mửa, tiêu chảy; ngoài ra còn có tác dụng cầm máu vết thương, chấn thương, trị viêm da, ecaema, rắn cắn |
|
9 |
Gan heo |
|
Myricetin, isoliquiritigenin, curcumin, atractylactone Ⅰ và physcion |
Bảo vệ và chống xơ gan |
Trị đau bụng, viêm ruột và tiêu chảy; bảo vệ gan |
|
10 |
Nga truật |
|
Glycopyrrolate, cucurbitacin I, flurandrenolide, 26,26,26,27,27,27-hexafluoro-1 alpha, propofol , 24-dihydroxyvitaminD3/26,26,26,27,27,27-hexafluoro-1 alpha, ibuprofen, proto porphyrinogen IX, Phenylbutazone glucuronide, methyl gamboginate |
Kháng khuẩn, chống ung thư, giảm đau, hạ sốt, kháng vi-rút, chống oxy hóa, chữa lành vết thương, chống viêm; hạ lipid máu, hỗ trợ làm lành vết thương; hoạt động bảo vệ tim mạch, bảo vệ gan |
Kinh nguyệt huyết khối, bế kinh, đau bụng kinh, đau bụng đầy trước, đau do thực tích khí trệ |
|
11 |
Mật nhân |
|
Eurycomanone, acid benzoic và acid gallic |
Chống sốt rét; gây độc tế bào, chống tăng sinh tế bào ung thư; kháng khuẩn, chống viêm; hỗ trợ phòng ngừa loãng xương, trị đái tháo đường |
Khí huyết lưỡng hư, cơ thể yếu mệt, thiếu máu, ăn uống kém; khó tiêu, các bệnh tả, lỵ; các trường hợp sinh dục yếu, dương suy, tảo tiết. Ngoài ra còn dung để chữa cảm mạo, phát sốt, sốt rét, giải độc rượu, tẩy giun |
|
12 |
Cà dại hoa trắng |
|
Một số steroid, steroidal glycoside, saponin, alkaloid, flavonoid và tannin như torvanol A, neochlorogenin 6-O-β-D-quinovopyranoside, neochlorogenin 6-O-β-D- xylopyranosyl- (1→3) -β- D-quinovopyranoside, neochlorogenin 6-O-α-L-rhamnopyranosyl- (1→3)-β-D- quinovopyranoside, solagenin 6-O-β-D-quinovo pyranoside, solagenin 6-O-α-L- rhamnopyranosyl- (1→3) -β-Dquinovopyranoside, isoquercetin, rutin, kaempferol và quercetin |
Kháng khuẩn, kháng virus, chống oxi hóa, giảm đau, kháng viêm |
Trị chân tay nứt nẻ, nước ăn chân, côn trùng đốt |
|
13 |
Hoa mua |
|
Triterpenoid (α-amyrin), alkaloid (patriscabratine, auranamide), flavonoid (quercetin, quercitrin và kaempferol-3-O-(2”,6”-di-O-p-trans-coumaroyl)-β-glucoside) |
Hoạt động kháng khuẩn, kháng vi-rút, chống ký sinh trùng, chống oxy hóa, gây độc tế bào, chống đông máu, ức chế yếu tố kích hoạt tiểu cầu, chữa lành vết thương, chống loét, chống tiêu chảy, chống nọc độc, chống viêm, chống nôn và hạ sốt |
Điều trị các bệnh về gan, viêm gan |
|
14 |
Thần xạ hương |
|
Flindissol, 3-oxotirucalla-7,24-dien-21-oic acid |
Gây độc tế bào |
Chữa xơ gan, cổ trướng |
|
15 |
Xăng mã |
|
Proanthocyanidinb (carallidin, mahuanin và para-hydroxy benzoic acid); megastigmane diglycoside (3-hydroxy-5,6-epoxy-β-ionol-3-O-βapiofuranosyl (1→6)-β-glucopyranoside), alkaloid (hygroline), tannin, flavonoid và glyceroglycolipid |
Giảm đau, kháng viêm, chống tiểu đường |
Chữa bệnh apto, viêm hầu, viêm họng. Vỏ dùng chữa ghẻ |
|
16 |
An xoa |
|
Phenolic, flavonoid, saponin |
Khả năng gây độc tế bào ung thư |
Trị bệnh về gan như xơ gan, ung thư gan (theo kinh nghiệm dân gian). |
|
17 |
Cò sen |
|
Stigmasterol, sitosterol, yagonin, 3-geranyl-2,5-dihydroxybenzaldehyde, methyl-2-(1′βgeranyl-5′β-hydroxy-2′-oxocyclohex-3′-enyl)acetate, acid 2-(1′β-geranyl5′β-hydroxy-2′-oxocyclohex-3′-enyl)acetic, , velutinindimer A, velutinindimer B, cananginone A, cananginone H, 4-hydroxybenzonitrile, 4-hydroxybenzaldehyde, isovanillin, 5-acetyloxymethylfurfural, 5-methoxyfurfural, 5-hydroxymethylfurfural, liriodenine, norcorydine, reticuline, (+)-isocorydine α-N-oxide, spathulenol và benzyl benzoate |
Kháng khuẩn, gây độc tế bào ung thư |
Trị viêm xoang mũi, ghẻ lở, bệnh ngoài dam hắc lào, mụn nhọt; đau dạ dày, viêm mắt |
|
18 |
Chua ke |
|
Flavonoid, phenol, tannin, saponin, steroid, glycoside, alkaloid (Microgrewiapine A, N-Methyl-microcosamine, Homomicrogrewiapine) terpenoid, coumarin |
Chống oxi hóa |
Chữa bệnh cảm lạnh, rối loạn tiêu hóa, viêm gan, đau đầu (theo kinh nghiệm dân gian). |
|
19 |
Núc nác |
|
Phenolic (anthraquinone, acid tannic and acid ellagic, alkaloid, và phytosterol); flavonoid (Baicalin, baicalein, biochanin A, oroxylin A, chrysin, apigenin, và các glycoside), alkaloid, triterpene; các acid béo (acid lauric, myristic, palmitic, stearic, oleic, và linoleic) |
Kháng khuẩn, kháng viêm, kháng ung thư, chống oxi hóa; giảm đau, chống viêm khớp, kích thích hệ miễn dịch, trị đái tháo đường, trị viêm đại tràng; bảo vệ gan, thận; làm lành vết thương |
Hoàng đản, mẩn ngứa dị ứng, viêm họng, đái buốt, đái dục, đái đỏ do bang qang thấp nhiệt45. Chữa ho lâu ngày, viêm khí quản, đau dạ dày, đau bụng; vết loét không liền miệng |
|
20 |
Màng màng trắng |
|
Acid phenolic (acid protocatechuic, acid p-hydroxybenzoic, acid salicylic, acid caffeic, p-coumaric acid, acid sinapic, acid ferulic) , glucosinolate, flavonoid (quercetin, kaempferol) |
Kháng nấm |
Viêm khớp, mụn nhọt, sốt, chống sốt rét, kiết lỵ [Cây có Việt Nam, Phạm Hoàng Hộ]. Chữa bệnh gan (theo kinh nghiệm dân gian) |
|
21 |
Ráy gai |
|
Phenolic (apigenin, acid cinnamic, Morin, acid 4-hydroxybenzoic, acid gentisic, acid syringic), acid béo (acid oleic, acid palmitic, Stearic acid) , tinh dầu (α-pinene, camphene, δ-3-carene, caryophyllene, limonene và α-selinene) |
Chống oxi hóa |
Chữa ho, đau họng, phù thũng, tê thấp, suy gan, di chứng sốt rét |
|
22 |
Dây chân chó |
|
Tannin, terpenoid, glycosidesư và alkaloid |
Giảm đau |
Trị mụn nhọt, ho ra máu |
|
23 |
Màng màng tím |
|
Tannin, saponin, flavonoid, alkaloid, glycoside tim |
Chống oxi hóa, kháng khuẩn |
Chữa viêm gan (theo kinh nghiệm dân gian). |
|
24 |
Lục lạc |
|
Pyrrolizidine alkaloid, tinh dầu và flavonoid glycoside apigenin và 2′-hydroxygenistein |
Kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxi hóa |
Chữa tiểu tiện nhiều lần, đái són, can thận kém, mờ mắt, di tính, viêm tuyến vú, chứng cam tích ở trẻ |
Mô hình xác định hoạt động của Nrf2 trên tế bào Huh7
Để xây dựng mô hình đánh giá hoạt động của Nrf2 trên tế bào Huh7, chúng tôi đã thiết lập một đọan DNA chứa yếu tố phản ứng oxi hóa (ARE - antioxidant response element), một đoạn gen chỉ thị luciferase Luc2p, gen kháng hygromycrin và một số yếu tố cần thiết khác vào lentivirus pLKO, sau đó chuyển nạp vào tế bào Huh7. Các tế bào Huh7 chuyển nạp thành công được chọn lọc và duy trì trong môi trường chứa hygromycin là các tế bào Huh7/ARE. Luteolin (LuT) được sử dụng làm tác nhân ức chế biểu hiện của Nrf2. Kết quả kiểm tra khả năng sống sót của tế bào trên nhóm đối chứng âm (DMSO) và đối chứng dương (Luteolin) lần lượt là 100±1% và 75±2% (Figure 1). Hoạt động của Nrf2 trên nhóm đối chứng âm DMSO là 100±5% và đối tế bào được xử lý với Luteolin (50 µM) là 17±7%. Kết quả này cho thấy nghiên cứu của chúng tôi đã xây dựng thành công mô hình xác định hoạt động tương đối của gen Nrf2 trên tế bào Huh7 với kết quả tế bào mang gen chuyển nạp có khả năng sống sót và biểu hiện Nrf2 sự ổn định.
Kết quả xác định khả năng sống sót và hoạt động của Nrf2 trên tế bào Huh7/ARE. DMSO được sử dụng làm đối chứng âm, với hoạt động của Nrf2 trên đối chứng DMSO được xem là 100%. Luteolin được sử dụng làm chất ức chế hoạt động của Nrf2, với nồng độ cuối cùng là 50 mM. Kết quả được thể hiện dưới dạng trung bình ± SD (n = 15).
Kết quả sàng lọc hoạt động của Nrf2 đối với 52 cao chiết từ các bộ phận khác nhau của 24 loài dược liệu
Kết quả sàng lọc tác động của 52 cao chiết từ các bộ phận khác nhau của 24 loài dược liệu
|
STT |
Dược liệu |
Bộ phận dùng |
Phần trăm tế bào sống sót (%, trung bình ± SD) |
Hoạt động của Nrf2 trên tế bào Huh7a (%, trung bình ± SD) |
|
1 |
Lá lốt |
Rễ |
84,5±12,3 |
10,9±2,1 |
|
Lá |
71,1±4,6 |
49,7±4,2 | ||
|
Thân |
86,2±16,2 |
64,3±6,8 | ||
|
2 |
Rau đắng đất |
Thân |
101,4±10,3 |
73,9±3,3 |
|
3 |
Mật gấu |
Lá |
95,2±11,7 |
32,0±3,7 |
|
4 |
Ngãi trắng |
Rễ |
101,7±9,5 |
40,5±2,6 |
|
Lá |
102,1±17,3 |
58,1±10,0 | ||
|
5 |
Chó đẻ thân xanh |
Rễ |
107,6±13,5 |
56,4±4,6 |
|
Thân |
98,2±13,7 |
39,0±1,5 | ||
|
6 |
Ngải quấn |
Lá |
96,4±9,4 |
85,3±5,4 |
|
7 |
Gừng gió |
Rễ |
89,8±9,7 |
132,3±6,1 |
|
Lá |
101,2±10,6 |
38,8±8,1 | ||
|
Thân |
126,7±10,1 |
101,3±12,6 | ||
|
8 |
É lớn tròng |
Rễ |
64,5±8,2 |
34,1±7,0 |
|
Thân |
49,8±9,2 |
41,1±5,5 | ||
|
Lá |
97,2±4,4 |
23,9±4,5 | ||
|
9 |
Gan heo Acanthaceae |
Thân |
103,7±5,4 |
63,7±2,5 |
|
Lá |
97,2±14,8 |
59,5±4,7 | ||
|
10 |
Nga truật |
Rễ |
96±12,7 |
43,1±2,2 |
|
Lá |
14,9±13,2 |
39,2±7,2 | ||
|
11 |
Mật nhân |
Thân |
95,8±12,5 |
44,3±2,5 |
|
Lá |
90,1±10,0 |
22,1±1,5 | ||
|
12 |
Cà dại hoa trắng |
Quả |
95,9±10,4 |
88,1±5,0 |
|
Thân rễ |
105,1±11,1 |
65,9±3,9 | ||
|
Lá |
78,5±10,5 |
43,2±5,3 | ||
|
13 |
Hoa mua |
Quả |
100,8±13,8 |
111,4±17,5 |
|
Thân |
87,9±10,5 |
64,3±4,1 | ||
|
Lá |
98,1±10,5 |
45,8±5,3 | ||
|
14 |
Thần xạ hương |
Lá |
28,7±15,9 |
23,1±1,0 |
|
15 |
Xăng mã |
Thân rễ |
87,3±6,6 |
40,6±5,4 |
|
Lá |
104,7±17,9 |
48,1±4,3 | ||
|
16 |
An xoa |
Lá |
92,9±9,2 |
39,8±1,4 |
|
17 |
Cò sen |
Thân |
104,6±15,0 |
91,0±18,7 |
|
Lá |
91,3±9,6 |
77,8±4,4 | ||
|
18 |
Chua ke |
Quả |
97,7±8,5 |
82,6±5,1 |
|
Thân |
113,0±12,0 |
75,7±4,1 | ||
|
Lá |
116,4±9,9 |
91,8±8,5 | ||
|
19 |
Núc nác |
Thân |
103,4±7,5 |
31,3±0,9 |
|
Lá |
114,7±10,1 |
40,9±8,0 | ||
|
20 |
Màng màng trắng |
Thân |
98,8±15,4 |
86,5±9,2 |
|
Lá |
100,8±10,7 |
54,7±3,4 | ||
|
21 |
Ráy gai |
Quả |
84,2±20,5 |
17,8±3,5 |
|
Thân rễ |
103,1±15,3 |
93,6±4,7 | ||
|
Thân |
100,5±16,7 |
85,7±5,7 | ||
|
Lá |
115,4±13,7 |
43,7±2,8 | ||
|
22 |
Dây chân chó |
Rễ |
80,7±15,0 |
53,6±12,9 |
|
Thân |
111,2±15,1 |
60,7±3,9 | ||
|
Lá |
122,3±10,4 |
57,3±2,0 | ||
|
23 |
Màng màng tím |
Thân |
116,5±11,0 |
103,0±8,2 |
|
Lá |
82,9±4,2 |
55,4±7,0 | ||
|
24 |
Lục lạc |
Thân |
83,4±19,6 |
72,1±5,1 |
|
Lá |
88,3±7,3 |
23,8±1,4 | ||
|
25 |
Luteolin (50 µM)b |
— |
28,3±2,5 | |
|
26 |
Đối chứng |
99,8±10,9 |
— |
Kết quả sàng lọc khả năng ức chế biểu hiện 52 cao chiết methanol từ các bộ phận khác nhau (rễ, lá, thân, quả, thân rễ) của 24 dược liệu được trình bày ở Table 3. Giá trị hoạt động tương đối của Nrf2 trên tế bào Huh7 (%) được khảo sát với nồng độ cao chiết là 100 µg/mL. Hoạt động tương đối của Nrf2 càng thấp cho thấy khả năng ức chế Nrf2 của cao chiết càng mạnh. Trong số 52 mẫu được khảo sát, rễ Lá lốt cho thấy khả năng ức chế Nrf2 tốt nhất với kết quả hoạt tính của Nrf2 chỉ còn 10,9±2,1% và không gây độc trên tế bào Huh7. Ngoài ra, một số cao chiết từ lá Mật gấu, thân cây Chó đẻ thân xanh, lá Gừng gió, lá và rễ É lớn tròng, lá cây Mật nhân, lá Thần xạ hương, lá An xoa, thân Núc nác, quả Ráy gai và lá Lục lạc cho kết quả ức chế hơn 60% hoạt động của Nrf2 trên tế bào Huh7 ở nồng độ 100 µg/mL. Hầu hết các mẫu cao chiết không gây độc trên tế bào ung thư Huh7, ngoại trừ cao chiết lá Nga truật và lá Thần xạ hương, với phần trăm tế bào sống sót lần lượt là 14,9±13,2 và 28,7±15,9%.
Thảo luận
Hiện nay, việc tác động lên Nrf2 được chia làm hai khuynh hướng: ức chế Nrf2 để khắc phục tình trạng kháng hóa trị hoặc/và kích hoạt Nrf2 để ngăn chặn hình thành ung thư do stress oxy hóa161, 162, 163. Trong nghiên cứu của chúng tôi, hầu hết các mẫu cao chiết có khả năng gây ức chế Nrf2 trên tế bào Huh7 đều không gây ra độc tính đáng kể lên tế bào, trừ trường hợp lá Nga truật và Lá Thần xạ hương. Trong số các cây ghi nhận khả năng ức chế Nrf2 mạnh trong nghiên cứu, những hợp chất tự nhiên nổi trội được phân lập từ các cây bao gồm những nhóm flavonoid, alkaloid, steroid và tinh dầu (Table 2).
Các thành phần chính trong rễ Lá Lốt được phân lập phần lớn là tinh dầu34, alkaloid33 và một vài hoạt chất flavonoid35. Đáng chú ý, tinh dầu asaricin và isoasarone phân lập từ rễ Lá Lốt từng được ghi nhận khả năng tăng tích lũy các gốc oxy hóa và thúc đẩy tín hiệu apoptosis của dòng tế bào ung thư vú ở người (MDA-MB-231) trong nghiên cứu trước đây43. Zerumbone là thành phần chính nổi trội trong tinh dầu của cây Gừng Gió. Hoạt chất này được ghi nhận gây ra quá trình chết theo chương trình ở các tế bào ung thư buồng trứng và tử cung164. Chó đẻ thân xanh có chứa lượng lớn các alkaloid, flavonoid, ellagitannin, lignan, sterol, và tinh dầu. Alkaloid securinine phân lập từ cây thuộc chi Phyllanthus có tác dụng tích lũy gốc oxy hóa trong tế bào HeLa và kích hoạt các tín hiệu apoptosis của ty thể165. Chó đẻ thân xanh được nghiên cứu để điều trị ung thư vú bằng cách làm giảm tiềm năng của màng ty thể, tăng các loại oxy phản ứng nội bào, điều chỉnh tăng biểu hiện caspase-3 và điều chỉnh giảm biểu hiện Bcl-2166. Ngoài ra sự hiện diện của acid gallic, gereniin, quercetin và rutin trong cây chó đẻ thân xanh thể hiện khả năng bắt giữ chu kỳ tế bào và điều hòa các tín hiệu phosphoryl hóa gây apoptosis166. Flavonoid chrysin phân lập từ Núc nác được chứng minh có khả năng điều chỉnh giảm con đường truyền tín hiệu Nrf2, qua đó làm tăng khả năng nhạy cảm thuốc hóa trị và gây độc trên tế bào BEL-7402 kháng doxorubicin167. Các nhóm flavonoid apigetrin, apigenin, luteolin trong cây Mật gấu được ghi nhận chống ung thư trên các tế bào ung thư vú 4T1 thông qua việc gây ra apoptosis, tăng cường tích lũy tế bào trên pha G2/M trong chu kỳ tế bào và ức chế biểu hiện của PI3K và mTOR168. Tinh dầu và các alkaloid, flavonoid, tannin, phenolic, và saponin chiết xuất từ cây É lớn tròng được chứng minh là thành phần chính cho thấy hoạt động chống ung thư trên dòng tế bào MCF-795. An xoa, Thần xạ hương được sử dụng trong bài thuốc cổ truyền để điều trị xơ gan, ung thư gan. Các hoạt chất tìm thấy trong cây An Xoa gồm những dẫn xuất của acid betulinic và dẫn xuất của flavonoid isoscutellarein ghi nhận hoạt tính kháng ung thư trung bình trên các dòng tế bào ung thư gan khác nhau169. Thần xạ hương được xem là phương thuốc quý trong việc hỗ trợ điều trị các bệnh xơ gan, cổ trướng và hỗ trợ điều trị ung thư theo kinh nghiệm dân gian; tuy nhiên vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về tác động dược lý của chúng. Nhìn chung, các dược liệu cho thấy khả năng gây ức chế Nrf2 trên tế bào Huh7 trong nghiên cứu này đều chứa các nhóm hợp chất có tác dụng dược lí đáng lưu tâm, đặc biệt là các flavonoid.
Nghiên cứu của chúng tôi là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam cho thấy khả năng ức chế hoạt động của Nrf2 trên tế bào Huh7 của cao chiết một số dược liệu Việt Nam. Nghiên cứu cũng đồng thời ghi nhận Nga Truật có khả năng gây độc mạnh trên tế bào Huh7 với phần trăm tế bào sống sót dưới 15% và khả năng ức chế Nrf2 hơn 50%. Bên cạnh khả năng kháng ung thư, hỗ trợ các bệnh lí về gan đã được nghiên cứu trước đây, nghiên cứu này đã chỉ ra khả năng ức chế hoạt động Nrf2 của các loài thực vật trên dòng tế bào Huh7. Điều này cho thấy tiềm năng của cây thuốc trong kìm hãm sự tiến triển của khối u và cải thiện tình trạng kháng thuốc của bệnh ung thư. Đồng thời mở ra hướng kết hợp dược liệu với các loại thuốc hoá trị hiện có để khắc phục tình trạng kháng thuốc170. Tuy nhiên, việc ức chế không chọn lọc hoạt động của Nrf2 có thể gây tác dụng phụ không mong muốn trên cơ thể của bệnh nhân ung thư vì điều này có thể làm giảm hiệu quả của hàng rào bảo vệ tự nhiên của bệnh nhân với thuốc hóa trị trên các tế bào thường171. Vì vậy cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa về hoạt tính của dược liệu liên quan đến cơ chế tác động trên Nrf2 của cả tế bào ung thư và các dòng tế bào thường.
Kết luận
Lần đầu tiên tại Việt Nam đã nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ức chế biểu hiện Nrf2 trên tế bào ung thư gan Huh7 của 52 cao chiết bằng methanol từ các bộ phận khác nhau như: thân, lá, rễ, thân rễ của 24 dược liệu/cây thuốc vốn được sử dụng trong dân gian và y học cổ truyền để hỗ trợ điều trị ung thư. Rễ lá lốt cho thấy khả năng ức chế Nrf2 trên tế bào ung thư gan Huh7 mạnh lên đến 90%. Cao chiết lá Mật gấu, thân cây Chó đẻ thân xanh, lá Gừng gió, lá và rễ É lớn tròng, lá cây Mật nhân, lá Thần xạ hương, lá An xoa, thân Núc nác, quả Ráy gai và lá Lục lạc cũng ức chế Nrf2 dưới 40% khả năng hoạt động trên tế bào Huh7. Ngoài ra, chúng tôi còn ghi nhận cao methanol lá Thần xạ hương và á Nga truật có khả năng gây độc tế bào ung thư hơn 70%. Những phát hiện này là cơ sở để chúng tôi thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động cũng như tìm ra các hoạt chất thiên nhiên có tác động đảo ngược tình trạng kháng thuốc điều trị thông qua việc ức chế biểu hiện của Nrf2 trên tế bào ung thư.
Lời cảm ơn
Nghiên cứu này được tài trợ bởi Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh trong khuôn khổ đề tài mã số B2023-44-01.
Danh mục từ viết tắt
DMEM: Môi trường Dullbecco có sửa biến đổi (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)
FBS: Huyết thanh nhau thai bò đã được bất hoạt bằng nhiệt (heat-inactivated fetal bovine serum)
Huh7: dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan Huh7 (Huh-7 human hepatocellular carcinoma cells)
Nrf2: Nuclear factor erythroid-2 p45-related factor 2
PCR: Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase-Chain-Reaction)
Xung đột lợi ích
Nhóm tác giả cam kết rằng không có xung đột lợi ích khi thực hiện nghiên cứu này.
Đóng góp của các tác giả
Tác giả Nguyễn Minh Hiền đưa ra ý tưởng và thiết kế thí nghiệm. Các tác giả Lê Nguyễn Thiên Hân, Nguyễn Thị Yến Nhi và Nguyễn Minh Hiền tiến hành thu thập mẫu, thực hiện thí nghiệm, thu thập, phân tích và xử lý số liệu. Tác giả Chia-Hung Yen hướng dẫn và hỗ trợ các thí nghiệm liên quan đến tế bào. Các tác giả Nguyễn Minh Hiền, Lê Nguyễn Thiên Hân, Nguyễn Thị Yến Nhi, Võ Thanh Hóa, Phạm Tấn Thi và Chia-Hung Yen tham gia viết bản thảo và chỉnh sửa nội dung bản thảo. Tất cả các tác giả đã đọc và duyệt bản thảo cuối cùng.